组培实验室培养基的配制注意事项

　　1. 培养基的配制注意事项

　　植物组织培养常用到MS培养基，包含十几种化合物。因为有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀，影响培养基的营养成分，准备MS培养基需要配制多种高倍母液。且配制母液时，尤其涉及大量元素的母液时，一定要等一种成分溶解之后，再缓慢的添加另一种成分，切记“一锅煮”，即不能将各种化合物一齐添加进去。可选用Coolaber的MS培养基基盐（PM1011）在自行加入蔗糖和琼脂配制MS培养基，既经济。

　　2. 灭菌后培养基不凝胶或者凝胶偏软

　　植物凝胶、琼脂都对酸性条件敏感，pH值低于5很难成胶或凝胶偏软，切记高压灭菌前调节培养基pH值（5.5-6.0）。植物凝胶对二价阳离子浓度有要求，也就是相对于MS培养基，1/2MS培养基中植物凝胶要适当增加用量。另外灭菌后，倒出培养基前一定将培养基摇匀（带防烫手套），因为是琼脂密度大底层含量高，容易造成培养基强度不均匀。选择Coolaber改良MS培养基（PM10121，pH5.8±0.2）含蔗糖和琼脂/植物凝胶，可以省去调pH步骤。

　　3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用过程中有无区别？

　　水解酪蛋白对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用，通常用量在500mg/L，不管是酸解还是酶解，作用都是一样的，酶解更有利于发挥其作用。

　　4. 怎么溶解组培常用植物激素？

　　IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等应先溶解于少量95%的乙醇中，再加水定容配制成母液；如有结晶析出，可考虑用1/10体积的乙醇溶解后再定容；2，4-D易溶于碱性水溶液，可用少量1mol/L的NaOH溶液溶解后再慢慢加水定容；KT和6-BA先用少量的HCL溶解，再加水定容到一定的浓度。

　　5. 细胞分裂素使用浓度？

　　一般情况下在培养基中加入0.1~10.0mg/L的细胞分裂素（6-BA/KT/ZT)，多数用1.0~2.0mg/L，KT浓度为0.5~2mg/L，这个也要根据实验材料来调整。细胞分裂素可以单独使用也可以与细胞生长素配合使用。

　　6. 哪些植物激素能高压灭菌，哪些不能高压灭菌。

　　IBA、NAA、6-BA、2,4-D可高温高压灭菌。 IAA、GA3、茉莉酸等不可高温高压灭菌，否则会分解失效，该类植物激素配制母液后需用0.22微孔滤膜过滤除菌，待培养基冷却（50-60℃）后尚未凝胶前加入混匀。

　　7. 培养基的pH值会凝胶硬度有无影响。

　　有影响。若将培养基pH值调的过高（大于6），则培养基偏硬，增加接种的阻力，会对外植体造成损伤。若将培养基pH值调的过低（小于4.5），则培养基不能凝固，起不到固定外植体的作用。一般将培养基的pH调节至5.5~6.0为宜。

　　8. 灭菌过程会否影响培养基的pH值？

　　培养基中的蔗糖和激素在高温灭菌过程中容易酸化，培养基pH值灭菌后会有所下降，灭菌前培养基的pH值偏低可能导致培养基不凝或偏软。要求偏酸性的培养基可适当增加琼脂或植物凝胶的用量。

　　9. 应用75%的酒精进行种子消毒的过程中需要注意的问题

　　种子在消毒过程中使用75%的酒精使用应慎重，酒精渗透力极强，消毒时间过长会直接影响种子发芽率，所以建议消毒时间不应超过1min。

　　10. 原始繁殖材料的消毒

　　组培中，作为原始繁殖材料的外植体消毒，直接影响整个培养过程的进行。从室外采回来的外植体需进行消毒，首先用自来水冲洗外植体，冲洗时间可根据采集部位不同而定，一般在5~15分钟即可；关键在于在超净台中进行药剂的处理，常用的药剂处理有70%的乙醇溶液、9%的次氯酸钠溶液、和0.1~0.2%的升汞溶液，具体可根据实验材料而定。应注意的是经升汞灭菌的外植体必须用无菌水冲洗6~8次。

　　11. 怎么处理植物组织培养过程中出现的各种污染？

　　植物组织培养过程中的污染来源主要分为3种，真菌、细菌和组织培养过程中的污染源。在操作过程中，难免有菌落入培养基或植物材料上，而导致污染。另外，不正确操作也会增加污染机率。预防措施：通风，保持室内空气干燥，紫外杀菌等。污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。