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植物组织实验室建设方案

  植物组织培养实验室所需的实验仪器和设备视实验目的而异,一般需配备以下一些实验设备。

  

  (一)超净工作台

  

  超净工作台是植物组织培养实验室主要的设备之一,是进行无菌操作所必需的。一般植物组织培养实验室多使用两种净化工作台:一种为侧流式或称为垂直式;另一种为外流式或称为水平层流式。两者的基本原理大致相同,都是将室内空气经粗过滤器初滤,由离心风机压入静压箱,再经空气过滤器精滤,由此送出的洁净气流以一均匀的断面风速通过无菌区,从而形成无尘、无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同,侧流式工作台空气净化后的气流由左侧或右侧通过工作台面流向对侧,也有从上向下或从下向上流向对侧的,都能形成气流屏障保持工作区无菌。但在净化气体和外边气体交界处可因气流的流动出现负压,使少许未净化气体混入,有发生污染的可能。侧流式净化台结构较为封闭,一般仅留两个手臂伸入的圆洞,操作和拿取较大物品不够方便。外流式工作台是使净化后的空气向操作者流动,因而外方气流不致混入操作区,但如果进行有害物质实验操作则对操作工作者不利。外流式工作台工作多为开放式,没有防护挡板,虽然操作和拿取物品较为方便,但可能受外界气流流动的影响而引起不洁空气混入。

  

  超净工作台是较为精密的设备,如果使用和维护得当,可以取得良好的效果并延长使用寿命。一般使用净化工作台需注意以下几点。①超净工作台安装在清洁无尘的房间内,以免尘土过多易使过滤器阻塞,降低净化效果,缩短使用寿命。②新安装的或长期未使用的工作台,工作前必须对工作台周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作,再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。③每次使用工作台时应先用70%乙醇擦洗台面,并提前30~50min打开紫外线灭菌灯进行处理,在关闭紫外线灭菌灯后启动送风机使之运转30min后再进行操作。④净化工作区内不应存放不必要的物品,以保持洁净气流不受干扰。⑤必须经常注意工作区上方微压表的指示,当指针从绿色区进入红色区时说明空气过滤的容尘量趋于饱和,一旦感到气流变弱(如酒精灯火焰不动),加大电动机电压也不见情况改变则说明滤器已被阻塞,应及时更换。一般情况下,过滤器三年更换一次。更换过滤器应请专业人员操作,以保持密封良好。要定期将过滤器中的过滤布(无纺布)拆下清洗,时间应根据环境洁净程度而定,通常间隔3~6个月进行一次。⑥每次使用超净工作台时要及时清除工作台面上的物品,并用70%乙醇擦洗台面使之始终保持洁净。

  

  (二)显微镜

  

  倒置显微镜是植物组织培养室所必需的仪器,用其观察并掌握细胞的生长情况和污染情况。好能配置带有照相系统的高质量相差显微镜,以便随时摄影、记录细胞的情况,将有助于开展科研工作。若有条件,还可添置解剖显微镜、荧光显微镜、数码摄录系统等装置。

  

  (三)培养箱

  

  如果要进行植物组织培养或原生质体培养,一般培养室的条件难于达到其要求,因此需配备可控光温的恒温箱。培养箱要具有较高的灵敏度。一般应选用隔水式或晶体管自控培养箱,这些培养箱比一般普通培养箱灵敏度高,温度也较稳定。实验室好能有两个培养箱,以便万一出现问题时可以替换使用而不影响工作。培养箱内空气必须保持清洁,定期以紫外线灭菌灯或70%乙醇擦拭消毒灭菌。同时还需保持箱内的相对湿度为100%,为防止培养液蒸发,箱内要放置盛有无菌蒸馏水的水槽。

  

  (四)干燥箱

  

  用于植物组织培养的器械、器皿要烘干才能使用,玻璃器皿需干热消毒灭菌。因此,植物组织培养实验室应配置有电热干燥箱。干热消毒灭菌时,升温较高,一般需达到160℃,有时可致包裹的纸或棉花烧焦,需要注意。常用的是鼓风式电热干燥箱。其点是温度均匀、效果较好。缺点是升温过程较慢。升温时不能先升温后鼓风,而应鼓风与升温同时开始。至100℃时,停止鼓风。消毒后,不能立即打开箱门以免骤冷而致玻璃器皿损坏,应该等温度自然下降至100℃以下时方可打开箱门。

  

  (五)纯水装置

  

  植物组织培养,特别是细胞培养和原生质体培养对水的质量要求很高,所用的水必须事先纯化处理。水纯化时可采用离子交换纯水装置或蒸馏器。离子交换纯水时,还不能有效去除有机物,因此用水时还需再蒸馏。进行植物组织培养时,配制各种培养液及试剂等均需使用重蒸馏水,即使对玻璃器皿进行冲洗,也应该用蒸馏水。目前国内使用较多的有自动双重纯水蒸馏器(石英管加热),使用方便、安全、蒸馏速度快。但使用这种蒸馏器必须注意维护,不可采用普通自来水蒸馏,以免蒸馏器内很快结满水垢。正确的使用方法是将经金属蒸馏器蒸馏的蒸馏水加入玻璃蒸馏器内进行蒸馏。一般配制培养液的用水应在配液前蒸馏,不宜使用存放数日的蒸馏水,以免影响培养用水的质量。

  

  (六)冰箱

  

  植物组织培养室必须配备有普通冰箱或冷藏箱,好有一台低温冰箱(-20℃)。前者用于储存培养液、母液、试剂和药品等培养用的物品及短期保存的组织标本。-20℃低温冰箱则用于储存那些需要冷冻保持生物活性的物质及较长时期存放的制剂(如酶)等。植物组织培养室的冰箱应专用,不得存放挥发、易燃等物质,且应保持清洁。

  

  (七)冷冻储存器

  

  植物组织培养工作中常需储存细胞,常用的是液氮容器。液氮容器有不同的类型及多种规格。选择购置液氮容器时需对容积大小、取放使用方便及液氮挥发量(经济)三种因素综合考虑。液氮容器的大小可为25~500L,可以储存1ML的安瓶瓶250~15000个。总体来说,液氮容器可分为窄颈瓶及宽颈瓶两大类,前者主要属液氮运输容器,液氮挥发慢故较经济,一般能维持1个月,但取放不方便;后者取放方便,但挥发率上升3倍,只能维持7~10d。另外,尚有一种专供输送临时使用的液氮运输瓶称为杜瓦瓶。液氮温度很低,使用时要防止冻伤。由于液氮不断挥发,应注意观察瓶中剩余液氮情况,及时定期补充液氮,避免挥发过多而致细胞受损。

  

  (八)离心机

  

  进行组织和细胞培养时,常需要制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤细胞、收集细胞等,因此要使用离心机。一般若需细胞沉降,使用80~l00g的离心力即可,太大可能会引起细胞的损伤。因此配置4000r/min的国产台式离心机,离心速度1000r/min即可。另外,可根据需要添加其他类型,如大容量或可调节温度的离心机等。

  

  (九)天平

  

  天平是必不可少的设备,常用的有两种:1/100天平,用于大量元素、蔗糖和琼脂等药品和材料的称重,可用电子天平、托盘天平或扭力天平;1/10000天平,用于微量元素、激素等药品的称重,目前一般都用电子天平。

  

  (十)高压蒸汽消毒锅

  

  高压蒸汽消毒锅是植物组织培养及其他生物实验室必备的实验设备,主要用于生物灭菌。条件好的实验室有进口的全自动高温高压灭菌锅,它是微计算机控温,容量大,使用方便,但价格昂贵。因此国内一般实验室使用的是手提式高压蒸汽消毒锅。手提式高压蒸汽消毒锅使用时应注意以下几点。①先取下锅盖向锅内加3L左右的清水,以接近锅底坐垫为准,注意加水适量,过多容易溅至消毒物上,过少容易烧干。急用时可加入热水。②将消毒物品用双层纸包装,内层可用软纸,外层用牛皮纸。不能放得太挤,以免影响空气流通,影响灭菌效果。③将锅盖盖好,注意将锅盖连接的软管插入铝篮的半圆形槽内,以使篮内感觉到的压力与压力表相通。注意锅盖与锅沿之间的橡皮垫要扣准,以免漏气。然后旋紧消毒器的螺丝。④接通电源,使其加热。待压力表升至0.5kg时,开放气阀门,放掉原来的空气,直到见到热气,如不见热气,需放第二次气。放气时用木棒;以免烫伤。⑤继续加热,使锅内压力达到l.2kg,保持20~30min。一般情况下超过1.5kg时会自动放气,如达到1.5kg仍不自动放气,则应关电源,使其停止加热。⑥到灭菌时间后关掉电源,使其自然冷却,或间歇放气数次,至完全减压后方可打开锅盖。⑦继续灭菌时,先检查并补充水量,再按上述步骤进行灭菌。用完后,将锅内的水倒掉,晾干保管。

  

  (十一)消毒器

  

  目前培养工作中采用的培养用液(包括人工合成培养液)、消化用酶等常含有维生素、蛋白质、多肽、生长因子等物质,这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能。因而上述液体多采用过滤消毒以除去细菌。目前常用的滤器有Zeiss滤器、玻璃滤器和微孔滤膜滤器。其中Zeiss滤器为不锈钢的金属结构,中间夹有一层石棉制成的一次性纤维滤板。滤板具有一定的厚度,可承受一定的压力,因此是过滤黏稠液体较理想的滤器。滤板有不同规格,进口的型号有EKSI,EKS2,EKS3等。国产的有甲1、甲2、甲3等,其中以EKS3及甲3过滤除菌的效果较好,但因孔径很小,速度较慢。

  

  Zeiss滤器可分为抽滤式或加压式。抽滤式滤器与抽滤瓶相连,真空泵抽气形成负压以过滤液体,其效率不如加压式。由于抽气造成负压抽吸,操作使用时要防止倒流而引起的污染。因此要注意避免将出、入管道接错;停止抽气时应使气体缓慢回流,要先用止血钳夹住抽气管再关机,防止气体回流。加压式滤器的容器为密闭式,加入待过滤的液体后,通以气体(常用N2,02或C02,形成压力将液体滤过,效果较佳。使用时注意压力不能过大,不应超过0.2kg/cm2。另外,由于使用的滤板为石棉,滤过的液体内有时可能混有少许杂质,因此在过滤前应先以少量生理盐水湿润滤板。

  

  Zeiss滤器的清洗比玻璃滤器简单,滤板属一次性,使用后即可弃去,以自来水将金属滤器初步冲洗,用洗涤剂刷洗干净,自来水冲净,蒸馏水漂洗2次或3次,晾干包装。消毒前将滤板装好,旋钮不要拧得太紧;消毒后立即将旋钮拧紧以保证过滤除菌的效果。

  

  玻璃滤器为玻璃结构,以烧结玻璃为滤板固定于玻璃漏斗上。可用于过滤各种培养液体。只能采用抽滤式。根据滤板孔径的大小,分为G1~G6 6种规格型号,其中只有G5及G6可用以过滤除菌,一般都使用G6型,但过滤速度较慢。玻璃滤器的使用方法与抽滤式Zeiss滤器相同,但清洗过程比较繁琐。

  

  微孔滤膜滤器的基本结构与Zeiss滤器相同,为金属结构,其中间为一种一次性的特制混合纤维素滤膜,可用于各种培养液体的过滤除菌,速度较快、效果较好,现已为许多实验室所使用。滤膜的规格很多,主要根据滤器的直径大小而划分其型号,可按待过滤液体的量来选择适当的型号。滤过大量培养液时,一般多用直径10cm(容器量为500mL)及直径15cm(容器量为2000mL)两种规格。用于小量培养液时,可选用2.5cm直径滤器,以注射器推动为压力而过滤。

  

  滤膜的选择是过滤消毒效果好坏的关键。有孔径为0.6um,0.45um,0.22um三种滤膜,过滤除菌时,好使用0.22um孔径的滤膜(可以除去细菌和霉菌)。由于滤膜很薄,在滤器的上层和下层的相应部位各有一个凹槽以放置一个硅胶垫圈来固定、压紧滤膜。安装滤膜时要注意,滤膜薄而且光滑,容易移动。千万不能装偏而使过滤失败;同时要注意滤膜的正反面,正面(光面)应向上。由于滤膜薄,承受压力有限,力量不能过大、过猛,以免造成滤膜破裂。大量培养液过滤通常装上两张膜,上面为0.4um,下面为0.22um。每次过滤完毕应打开滤器,核实滤膜是否摇动或破裂,以保证有效过滤除菌。

  

  微孔滤膜滤器的清洗、消毒方法和Zeiss滤器相同,滤膜使用后即丢弃。

  

  另外,还有一种一次性小滤器,过滤较多液体时可连接在加压蠕动泵上,如过滤少量液体,可直接按在注射器上,使用非常方便。

  

  (十二)培养用器皿

  

  供植物组织培养和接种、生长等用的器皿,可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。目前国内实验室仍多用玻璃培养器皿,其点是易于清洗、消毒,可反复使用,并且透明而便于观察。玻璃培养器皿的缺点是易碎,清洗时费人力。国外实验室则多用塑料制培养器皿,点是一次性使用,厂家已消毒灭菌密封包装,打开包装即可用于培养操作,非常方便,但费用较高。

  

  培养容器的选择取决于实验性质,也取决于使用方便以及研究工作者的爱好,其中玻璃皿、玻璃试管等玻璃器皿是广泛应用的容器。另外,各种大小的广口玻璃瓶,甚至牛奶瓶和罐头瓶也都可以利用,特别在快速繁殖时更是如此。但应当明确,植物组织培养中只能使用硼硅酸盐玻璃器皿,钠玻璃对某些组织可能是有毒的,重复使用时毒害会更加明显。

  

  现在玻璃培养容器和制备培养基所需的其他玻璃器皿都正在被塑料器皿所取代。这些塑料容器可以进行高压灭菌。另外,有些塑料容器,特别是用于原生质体、细胞、组织和器官培养的容器,在出厂时即是无菌的。这种一次性消耗品在国外已得到普遍应用,在国内已有生产。

  

  在培养时如果使用一次性塑料容器或带螺口盖的玻璃器皿,无需另外配盖。如果使用试管或细口瓶,传统的封口办法是用棉塞,有时在棉塞外层再包上一层纱布。不过,如果觉得这种封口办法费时、费事,还可以有很多别的办法,如可以从市场上购买塑料(聚丙烯)或金属(铝或不锈钢)瓶盖或试管帽。但要注意这些材料是否可以进行高压灭菌。近几年在国外流行一种新型的聚丙烯塑料试管帽,透明,可进行高压灭菌,盖顶有一层薄膜,它可以阻止试管内水分的丢失,又不影响内外的空气交换。此外,利用耐高温、高压的透明塑料封口,以橡皮圈扎,也不失为一种经济有效的办法。高质量的牛皮纸也是一种很好的材料,而且牛皮纸能通水气,不影响培养物的正常生长。

  

  常用的培养器皿有以下几种。

  

  培养瓶:由玻璃或塑料制成,主要用于培养、繁殖植物组织和细胞。进行培养时培养瓶瓶口以螺旋盖或胶塞盖住,胶塞用于密封培养。国产培养瓶的规格常以容量(mL)表示,如250mL,1OOmL,25mL等;进口培养瓶则多以底面积(cm2)表示。

  

  培养皿:由玻璃或塑料制成,用于培养、繁殖植物组织和细胞,也用于单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿直径规格有1Ocm,9cm,6cm,5cm,3cm等。

  

  多孔培养板:为塑料制品,可供细胞克隆及药效检测等各种检测实验使用。其点是节约样本及试剂,可同时测试大量样本。每块培养板有多孔,常用的规格有96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。

  

  (十三)培养操作器皿

  

  玻璃瓶:主要用于存放或配制各种培养用液体(如培养液和试剂)等。有各种不同规格,如100OmL, 500mL,250mL, 100mL, 50mL, 5mL等。也可用生理盐水瓶、葡萄糖液瓶、血浆瓶或青霉素瓶、链霉素瓶代替。

  

  吸管:主要有刻度吸管及尖吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体,常用的有1mL,2mL, 5mL, 1OmL等规格。尖吸管又有直头吸管及弯头吸管之分,除可作吸取、转移液体之用外,弯头尖吸管还常用于吹打、混匀及传代细胞。

  

  加样器:用于吸取、移动液体或滴加样本。可根据需要调节量的大小,吸量准确、方便,尤以微量加样器效果好,可保证实验样品(或试剂)含量精确,重复性良好。

  

  此外,还有收集细胞用的离心管,放置试剂或临时插置吸管用的试管,装放吸管以便于消毒的大玻璃筒,用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝饭盒或储槽,套于吸管顶部的橡皮吸头,封闭各种瓶、管的胶塞、盖子,冻存细胞用的冻存管,不同规格的注射器、烧杯和量筒、漏斗等。

  

  (十四)培养操作器械

  

  此类器械主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。常用的有:手术刀或解剖刀、手术剪或解剖剪(弯剪及直剪),用于解剖、分离及切剪组织,制备培养的材料;镊子(弯、直)和解剖针,用于持取培养物等。


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