外植体的消毒
植物组织培养用的外植体大部分取自田间,表面上附着大量的微生物,这是组织培养的一大障碍。因此在材料接种培养前必须要消毒处理,消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭,同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。因此,外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要一环。
(1)常用的消毒剂
常用的消毒剂如下表所示。理想的消毒剂应具有消毒效果好,易被无菌水冲洗掉或能自行分解,对材料损伤小,对人体及其他生物无害,来源广泛,价格低廉。
常用消毒剂的使用方法及效果
①酒精
酒精是最常用的表面消毒剂,以70%~75%酒精杀菌效果最好,95%或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固,形成一层干燥膜,阻止了酒精的继续渗入,杀菌效果大大降低。
酒精具有较强的穿透力,使菌体蛋白质变性,杀菌效果好。同时它还具有较强的湿润作用,可排除材料上的空气,利于其他消毒剂的渗入。但酒精对植物材料的杀伤作用也很大,浸泡时间过长,植物材料的生长将会受到影响,甚至被酒精杀死,使用时应严格控制时间。但酒精不能彻底消毒,一般不单独使用,多与其他消毒剂配合使用。
②升汞
又称氯化汞,Hg2+可以与带负电荷的蛋白质结合,使蛋白质变性,从而杀死菌体。升汞的消毒效果极佳,但易在植物材料上残留,消毒后需用无菌水反复多次冲洗。升汞对环境危害大,对人畜的毒性极强,使用后应做好回收工作。
③次氯酸钠
次氯酸钠是一种较好的消毒剂,它可以释放出活性氯离子,从而杀死菌体。其消毒能力很强,不易残留,对环境无害。但次氯酸钠溶液碱性很强,对植物材料也有一定的破坏作用。
④漂白粉
漂白粉的有效成分是次氯酸钙[Ca(ClO)2],消毒效果很好,对环境无害。它易吸潮散失有效氯而失效,故要密封保藏。
⑤过氧化氢
也称双氧水,消毒效果好,易清除,又不会损伤外植体,常用于叶片的消毒。
⑥新洁尔灭
这是一种广普表面活性消毒剂,对绝大多数植物外植体伤害很小,杀菌效果好。
(2)消毒方法
①茎尖、茎段及叶片等的消毒
消毒前先对植物组织进行修整,去掉不需要的部分,然后用自来水冲洗。对于一些表面不光滑或长有绒毛的材料,可用洗涤剂清洗,必要时用毛刷充分刷洗,硬质材料可用刀刮。
消毒时在超净台上操作,先用70%酒精浸泡10~30s,以无菌水冲洗2~3次,然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度,分别采用2%次氯酸钠浸泡10~15min或用0.1%升汞浸5~10min。消毒时要不断搅动,使植物材料与消毒剂充分地接触。若材料有绒毛,最好在消毒液中加入几滴Tween-20,最后用无菌水冲洗3~5次。
②果实及种子的消毒先用自来水冲洗10~20min,再用酒精迅速漂洗一下。果实用2%次氯酸钠浸10min,后用无菌水冲洗2~3次。种子 则先用10%次氯酸钠浸泡20~30min,难以消毒的可用0.1%升汞消毒5~10min。对于种皮太硬的种子,也可预先去掉种皮,再用4%次氯酸钠浸泡8~10min。
③花药的消毒用于组织培养的花药多未成熟,其外面有花萼、花瓣或颖片保护,处于无菌状态。消毒时将整个花蕾或幼穗用70%酒精浸泡数秒钟,然后用无菌水冲洗2~3次,再在漂白粉中浸泡10min,最后用无菌水冲洗2~3次。
④根及底下部器官的消毒由于这类材料生长于土壤中,表面带菌量大,消毒较为困难。可 先用自来水冲洗,软毛刷刷洗,用刀切去损伤及污染严重部位,再用酒精漂洗后,置于0.1%升汞中浸5~10min或2%次氯酸钠中浸10~15min,最后用无菌水冲洗3次。在操作时要根据材料的大小、幼嫩、 质地等差异做出判断后,再选择适宜的消毒剂种类、浓度和消毒时间,切不可生搬硬套。消毒的最佳效果应以最大限度地杀死材料上的微生物,而又对材料的损伤最小为好。